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As leishmanioses constituem um complexo de enfermidades que atingem o homem, causadas por diferentes espécies morfologicamente semelhantes, sendo diferenciadas apenas por métodos bioquímicos, imunológicos ou mesmo patológicos. No Novo Mundo diversas ordens de mamíferos silvestres (reservatórios naturais) e várias espécies de flebotomíneos (vetores) estão envolvidos na transmissão da leishmaniose. A maioria dos casos de infecções humanas estão relacionadas com hábitos, atividades primárias ou secundárias de indivíduos que exploram ou habitam florestas. Recentemente tem ocorrido um aumento significativo nos casos de leishmanioses em áreas peri-urbanas de grandes cidades, particularmente no Brasil. A leishmaniose tegumentar é particularmente importante na América do Sul por apresentar aspectos de cronicidade, latência e por desenvolver metástases que conduzem a quadros clínicos desfigurantes. Estas lesões podem ser conseqüência de uma infecção recorrente, cuja origem pode ser uma reativação da primo infecção após longo período de latência ou uma reinfecção. Neste último caso, as cepas isoladas inicialmente e na fase recorrente são diferentes. A leishmaniose recorrente, que surge em conseqüência de uma reativação, vem recebendo maior atenção; não apenas pelo envolvimento de lesões em mucosas - mais difíceis de serem tratadas - mas também por surgirem em conseqüência de estados de imunodeficiência.  Os parasitas do gênero Leishmania (Ross, 1903) são flagelados da Família Trypanosomatidae (Doflein, 1901; Woodcock, 1906.), Ordem Kinetoplastida (Honigberg, 1963; Vickerman, 1976), Filo Protozoa. A ordem Kinetoplastida caracteriza-se por apresentar uma mitocôndria única (denominada cinetoplasto) rica em DNA mitocondrial, o kDNA (Simpson, 1987; Wirth, 1990). Esta organela localiza-se anteriormente ao cinetossoma do flagelo, perpendicularmente ao eixo maior do organismo, tendo sido muito estudada no gênero Leishmania (Chakrabarty e cols., 1962). As características morfológicas dos gêneros que compõem a família Trypanosomatidae são bem homogêneas, sendo que todas as espécies desta família são parasitas. Os tripanosomatídeos apresentam uma rede de microtúbulos subpeliculares bastante rígida, conferindo a estes protozoários formas celulares bem definidas durante seu ciclo evolutivo (Chang e col., 1985) Os Parasitas do gênero Leishmania são digenéticos (heteroxenos) e apresentam em seu ciclo de vida apenas duas formas evolutivas: a forma promastigota, que é flagelada e extracelular, e a forma amastigota, que é intracelular e sem movimentos. As promastigotas apresentam corpo alongado, medindo entre 14 e 20mm e flagelo livre. As amastigotas têm corpo ovóide, medindo entre 2,1 e 3,2mm e flagelo interno (Pêssoa & Martins, 1982).Existe uma enorme dificuldade na classificação das espécies do gênero Leishmania, devido a grande semelhança morfológica entre elas (Chance,1979). Inicialmente, o gênero Leishmania tinha suas espécies identificadas em função do aspecto clínico das doenças, (Pêssoa, 1941a; 1961) muito embora os dados epidemiológicos envolvendo uma grande variedade de vetores e reservatórios sugerisse que este gênero seria certamente composto de populações de parasitas extremamente heterogêneas. Baseados em critérios extrínsecos, que tendem a gerar uma classificação artificial (Lumsden, 1977), tais como comportamento do parasita em cultura e em hamster, Lainson e Shaw (1972) reuniram as espécies de Leishmania em 3 complexos: complexo Leishmania braziliensis, Leishmania mexicana e Leishmania donovani. A classificação atual das espécies deste gênero baseia-se em características clínicas e epidemiológicas, apoiada por aspectos biológicos, bioquímicos e moleculares (WHO, 1990). Diferenças morfológicas entre as espécies parasitas do homem foram demonstradas por Shaw & Lainson (1976), usando técnicas de impressão, fixação, coloração e microfotografia. Mais recentemente, vários pesquisadores têm empregado métodos bioquímicos para caracterização de parasitas, como a densidade de flutuação do DNA nuclear e do cinetoplasto (Chance e cols., 1974), hibridização de ADN e ARN, análise eletroforética de produtos do ADN do cinetoplasto clivados por enzimas de restrição (esquisodema), mobilidade eletroforética de isoenzimas (Ebert, 1973; Brazil, 1978; Gardener e cols,1974), radiorespirometria (Decker e cols., 1977), anticorpos monoclonais (Pratt, 1981) e análise de antígenos de diferenciação em promastigotas ou seus fatores de excreção (Schnur e Zuckerman, 1977; Schnur e cols., 1972 e 1974). Atualmente aceita-se como razoável classificar as Leishmanias que infectam o homem em complexos fenotípicos, agrupados em dois subgêneros, cada um englobando várias espécies (Lainson & Shaw, 1987): a) Subgênero Viannia (que inclui o complexo braziliensis, guyanensis, lainsoni, naifi ), as Leishmanias apresentam desenvolvimento pobre em meio de cultivo NNN convencional, desenvolvimento lento ou visceralizante em hamsters experimentalmente infectados e desenvolvem-se no intestino posterior do flebotomíneo, aderidos à parede, na região do piloro; b) Subgênero Leishmania (que inclui o complexo mexicana, mexicana, infantum, amazonensis, enrietii, hertigi), as Leishmanias crescem facilmente em cultura, provocam grandes lesões nodulares em hamster, com metástases para as extremidades e se desenvolvem no intestino médio e anterior do flebotomíneo (Marzochi, 1992). No Novo Mundo, são reconhecidas oito espécies de Leishmanias responsáveis pela doença no homem (Grimaldi Jr., G. e cols., 1989), pertencentes ao subgênero Viannia (V) e Leishmania (L):
A PI0004507-1 refere-se a "MÉTODO E KIT PARA A DIFERENCIAÇÃO DE LEISHMANIA (VIANNIA) de LEISHMANIA (LEISHMANIA), CAUSADORAS DE LEISHMANIOSE, POR PCR-RFLP". O objetivo da presente invenção é a diferenciação molecular das espécies de parasitos Leishmania (Viannia) de L. (Leishmania), mais particularmente, entre os subgêneros das espécies Leishmania (Viannia) braziliensis e/ou L. (V.) guyanensis de L. (Leishmania) amazonensis, através de PCR-RFLP. Uma primeira concretização da presente invenção diz respeito a um método de diferenciação entre essas duas espécies de Leishmania, através da amplificação por PCR da região conservada do minicírculo do KDNA de Leishmania, seguida de clivagem dos produtos da PCR com uma enzima de restrição específica e análise dos fragmentos gerados por técnica apropriada como, por exemplo, por RFLP. Numa segunda concretização, a invenção é dirigida a kit diagnóstico a ser utilizado no método de diferenciação entre as espécies de parasitos Leishmania (Viannia) de L. (Leishmania), mais particularmente, L. (V.) braziliensis e/ou L. ( V.) guyanensis de L. (L.) amazonensis da presente invenção compreendendo todos os reagentes necessários para a realização da técnica de PCR, a saber: iniciadores específicos, nucleotídeos e solução tampão apropriada para a amplificação por PCR, Taq polimerase, enzima de restrição e tampão adequado, DNA de cepas referência das espécies LeIshmania (ViannIa) e L. (Leishmania), mais particularmente, L. (V.) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis e L. (L.) amazonensis, para servirem de padrão e um protocolo e manual para instruir o usuário.  Alvaro Jose Romanha possui graduação em Farmácia e Bioquímica (1972) Especialização em Bioquímica (1976), Doutorado em Bioquímica e Imunologia - Departamento de Bioquímica e Imunologia da Universidade Federal de Minas Gerais (1982). Pós-Doutorado pela Wellcome Research Laboratories - Inglaterra (1984). Pesquisador titular aposentado em atividade e ex-Diretor do Centro de Pesquisas René Rachou Fiocruz MG, atualmente, Professor visitante do departamento de Micro, Imuno e Parasitologia da UFSC. Área de Atuação: Parasitologia celular e molecular, diagnóstico das doenças de Chagas, Leishmaniose e Esquistossomose, quimioterapia experimental da doença de Chagas, busca de novas drogas, associações de drogas e novos alvos terapêuticos. Fonte: http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.jsp?id=K4787017H2 http://www.dbbm.fiocruz.br/tropical/leishman/leishext/html/classifica__o_das_esp_cies.htm acesso em maio de 2011 envie seus comentários para otimistarj@gmail.com. |